Perfil genético de los tumores embrionarios del sistema nervioso

noviembre 5, 2007 at 8:30 pm Deja un comentario

 

571-cgh-nb.jpg

María del Mar Inda*, Teresa Tuñón**, Javier S. Castresana*
* Unidad de Biología de Tumores Cerebrales, Universidad de Navarra, Pamplona ESPAÑA
** Servicio de Anatomía Patológica, Hospital de Navarra, Pamplona ESPAÑA

Los tumores embrionarios son tumores indiferenciados de células redondas que muestran diferentes patrones de diferenciación. Representan un grupo heterogéneo de tumores del sistema nervioso central (SNC) y del periférico (SNP), y tanto su origen como su clasificación histopatológica no están claras. El meduloblastoma es el PNET del SNC más común en la edad pediátrica, suponiendo el 20-25% de los tumores cerebrales. Los PNET supratentoriales son histológicamente similares a los meduloblastomas, pero su pronóstico es más agresivo que el de éstos. El tumor embrionario más frecuente del SNP es el neuroblastoma, que presenta características histológicas similares a los PNET centrales con diferenciación neuronal.
A fin de estudiar las posibles diferencias en el perfil genético de los tumores embrionarios del sistema nervioso, realizamos técnicas de análisis de deleciones homocigóticas, hipermetilación de promotores, y expresión a nivel de RNA en diversos genes supresores de tumores, así como la técnica de hibridación genómica comparada (CGH) sobre un total de 78 tumores embrionarios, que incluian 52 PNET del SNC (37 meduloblastomas y 15 PNET supratentoriales), y 26 tumores neuroblásticos del SNP (16 neuroblastomas, 7 ganglioneuroblastomas, y 3 ganglioneuromas).


Los resultados confirman la hipótesis de que los tumores embrionarios del sistema nervioso constituyen diferentes entidades genéticas con diferentes alteraciones moleculares, independientemente de la apariencia histológica similar que presentan.
Los tumores embrionarios o tumores neuroectodérmicos primitivos (PNET) son tumores indiferenciados de células redondas, con núcleo hipercromático y escaso citoplasma, alto cociente núcleo/citoplásmico y diferentes patrones de diferenciación (neuronal, glial, ependimario…). Representan un grupo heterogéneo de tumores del sistema nervioso central (SNC) y del periférico (SNP), y tanto su origen como su clasificación histopatológica no están claras. El meduloblastoma (MB) es el PNET del SNC más común en la edad pediátrica, suponiendo el 20-25% de los tumores cerebrales. Los PNET supratentoriales son histológicamente similares a los meduloblastomas, pero su pronóstico es más agresivo que el de éstos. El tumor embrionario más frecuente del SNP es el neuroblastoma (NB), que pertenece al grupo de los tumores neuroblásticos y presenta características histológicas similares a los PNET centrales con diferenciación neuronal. Si bien los MB y los PNET supratentoriales pertenecen al grado IV de la OMS, los tumores neuroblásticos pueden presentar grados entre el I y el IV, aunque la clasificación del International Neuroblastoma Pathology Committee se sigue más que la de la OMS en el caso de los tumores neuroblásticos, con la idea de dar una clara orientación de pronóstico. Es una clasificación basada en el grado de diferenciación neuroblástico y la cantidad de estroma de Schwan. En esa clasificación se proponen cuatro tipos de tumores neuroblásticos, ordenados a continuación en orden de peor a mejor pronóstico: neuroblastoma, ganglioneuroblastoma nodular, ganglioneuroblastoma entremezclado, y ganglioneuroma

A nivel genético el MB se caracteriza por la presencia del isocromosoma 17q [i(17q)], así como por pérdidas en 17p, 10q y 1q, y ganancias en el cromosoma 7. Los NB se caracterizan por la amplificación de MYCN, las pérdidas de 1p y 11q, y las ganancias de 17q. Los PNET supratentoriales, por el contrario, carecen de definición genética, debido al escaso número de estudios realizados específicamente en este tipo de tumores. Generalmente, la bibliografía nos muestra estudios de los tumores embrionarios del sistema nervioso bajo el nombre genérico de PNET, pero casi la totalidad de los mismos se refieren específicamente a MB, y no a PNET supratentoriales. Por todo ello, el estudio presente pretende demostrar las diferencias que, a nivel genético pudieran existir entre los PNET supratentoriales y los MB, hasta ahora incluidos en un mismo grupo de clasificación genética. Además hemos estudiado mediante CGH (hibridación genómica comparada), un grupo de tumores neuroblásticos de varios tipos histológicos, a fin de determinar el perfil de pérdidas y ganancias de loci cromosómicos en los NB (tumores embrionarios del SNP), frente a los MB y PNET supratentoriales (tumores embrionarios del SNC).

Se estudiaron un total de 37 MB, 15 PNET supratentoriales y 26 tumores neuroblásticos (16 neuroblastomas, 7 ganglioneuroblastomas y 3 ganglioneuromas), además de 7 líneas celulares de MB y PNET, y DNA de sangre de 30 donantes sanos, según se indica en la Figura 1. El diseño experimental (Figura 2 a Figura 5) se hizo de tal manera que los tumores incluidos en parafina y los congelados se utilizaron para técnicas distintas. Así, los incluidos en parafina se sometieron a ensayos de PCR diferencial para el análisis de deleciones homocigóticas, y a ensayos de MSP (PCR específica de metilación) para el análisis de hipermetilación de promotores, mientras que los tumores congelados se sometieron a análisis de CGH (hibridación genómica comparada) para la determinación global de ganancias y pérdidas de material genético a nivel cromosómico. Las líneas celulares se emplearon sobre todo para el análisis de expresión, ya que no se disponía de RNA de los tumores.
Los genes sometidos a estudio fueron genes localizados en el cromosoma 10q, en concreto PTEN (no confundir con PNET) y DMBT1; el locus CDKN2A (con dos genes: p14ARF y p16INK4A) del cromosoma 9p; y el gen RASSF1A, del cromosoma 3p. Todos estos brazos o loci cromosómicos participan en la génesis o progresión de diversos tumores cerebrales, como astrocitomas o MB.
Las Figuras 6-8 incluyen esquemas de comprensión de las técnicas utilizadas.

 

Material tumoral, lneas celulares y controles sometidos a estudio.
Figura 1: Material tumoral, líneas celulares y controles sometidos a estudio.


Diseño experimental para el análisis de deleciones homocigóticas mediante PCR diferencial.
Figura 2: Diseño experimental para el análisis de deleciones homocigóticas mediante PCR diferencial.


Diseño experimental para el análisis de hipermetilación de promotores mediante PCR especfica de metilación (MSP).
Figura 3: Diseño experimental para el análisis de hipermetilación de promotores mediante PCR específica de metilación (MSP).


Diseño experimental para el análisis de expresión génica mediante RT-PCR.
Figura 4: Diseño experimental para el análisis de expresión génica mediante RT-PCR.


Diseño experimental para el análisis de pérdidas y ganancias de DNA a nivel cromosómico mediante CGH (hibridación genómica comparada).
Figura 5: Diseño experimental para el análisis de pérdidas y ganancias de DNA a nivel cromosómico mediante CGH (hibridación genómica comparada).


Esquema técnico para el análisis de deleciones homocigóticas mediante PCR diferencial.
Figura 6: Esquema técnico para el análisis de deleciones homocigóticas mediante PCR diferencial.


Esquema técnico para el análisis de hipermetilación de promotores mediante MSP (PCR especfica de metilación).
Figura 7: Esquema técnico para el análisis de hipermetilación de promotores mediante MSP (PCR específica de metilación).


Esquema técnico para el análisis de pérdidas y ganancias de DNA a nivel cromosómico mediante CGH (hibridación genómica comparada).
Figura 8: Esquema técnico para el análisis de pérdidas y ganancias de DNA a nivel cromosómico mediante CGH (hibridación genómica comparada).


Los resultados correspondientes a los experimentos de determinación de deleciones homocigóticas, hipermetilación de promotores y expresión a nivel de RNA se encuentran resumidos en las Figuras 9-11.
CGH (Figura 12 a Figura 17):
La alteración más frecuente en los PNET centrales fue la pérdida del cromosoma 17p, en 9 casos (45%), seguida de la ganancia de los cromosomas 1q, 7 y 17q, y de la pérdida del 16p en 7 casos (35%). La ganancia de 17q se dio en 8 casos de tumores neuroblásticos (35%). Otras alteraciones fueron ganancia del cromosoma 7, pérdida del 11q en 6 casos (26%), y ganancia a nivel del locus MYCN en 5 casos (22%). La ganancia de 1p, pérdida de 8q, ganancia de 9p, y pérdida de 17p mostraron asociación estadísticamente significativa con los PNET centrales (p<0.05). Al comparar los perfiles CGH de los PNET supratentoriales y los meduloblastomas, se detectó que en meduloblastomas la alteración más frecuente fue la pérdida de 17p (50%), asociada generalmente a ganancia de 17q (36%), lo que sugiere la formación de un isocromosoma 17q [i(17q)] que no ha sido detectado en PNET supratentoriales. La pérdida de 10q fue más frecuente en meduloblastomas (43%), sugiriendo que algunos genes localizados en este brazo cromosómico (PTEN, DMBT1) podrían ser de interés en la patogenia de los meduloblastomas, pero no de los PNET supratentoriales. Las diferencias en los perfiles genéticos entre meduloblastomas y PNET supratentoriales no fueron significativas.

 

Resultados de deleciones homocigóticas en los genes PTEN y DMBT1 y en el locus CDKN2A (genes p14ARF y p16INK4)
Figura 9: Resultados de deleciones homocigóticas en los genes PTEN y DMBT1 y en el locus CDKN2A (genes p14ARF y p16INK4)


Resultados de hipermetilación de promotores en los genes PTEN, p14ARF, p16INK4 y RASSF1A.
Figura 10: Resultados de hipermetilación de promotores en los genes PTEN, p14ARF, p16INK4 y RASSF1A.


Resultados de expresión a nivel de RNA de los genes PTEN, DMBT1, p14ARF, p16INK4 y RASSF1A, en lneas celulares mediante RT-PCR
Figura 11: Resultados de expresión a nivel de RNA de los genes PTEN, DMBT1, p14ARF, p16INK4 y RASSF1A, en líneas celulares mediante RT-PCR


Ejemplo de metafase para CGH. Las flechas verdes indican ganancias; las rojas, pérdidas; y las amarillas, normalidad en el número de copias de DNA.
Figura 12: Ejemplo de metafase para CGH. Las flechas verdes indican ganancias; las rojas, pérdidas; y las amarillas, normalidad en el número de copias de DNA.


Ejemplo de un cariotipo para CGH. Corresponde a un caso de DNA tumoral. Se aprecian claramente los colores verdes (ganancias) y rojos (pérdidas).
Figura 13: Ejemplo de un cariotipo para CGH. Corresponde a un caso de DNA tumoral. Se aprecian claramente los colores verdes (ganancias) y rojos (pérdidas).


<a mce_thref=http://www.conganat.org/7congreso//imagenes_trabajos/571-6.CGH-idiograma.jpg target=_blank>Ejemplo de idiograma CGH de un caso de DNA tumoral de un paciente. Los números en negrita corresponden a cada uno de los cromosomas, y los números seguidos de la letra n corresponden al número de veces que cada cromosoma especfico ha sido analizado.</a>
Figura 14: Ejemplo de idiograma CGH de un caso de DNA tumoral de un paciente. Los números en negrita corresponden a cada uno de los cromosomas, y los números seguidos de la letra n corresponden al número de veces que cada cromosoma específico ha sido analizado.


Resultados del análisis mediante CGH en MB y en PNET supratentoriales, mostrándose las alteraciones más frecuentes en cada uno de ellos.
Figura 15: Resultados del análisis mediante CGH en MB y en PNET supratentoriales, mostrándose las alteraciones más frecuentes en cada uno de ellos.


Comparación de lesiones detectables mediante CGH y frecuencia de las mismas, en MB y PNET supratentoriales
Figura 16: Comparación de lesiones detectables mediante CGH y frecuencia de las mismas, en MB y PNET supratentoriales


Resultados del análisis de CGH en tumores neuroblásticos.
Figura 17: Resultados del análisis de CGH en tumores neuroblásticos.

Deleciones homocigóticas
1. Nuestros resultados, aunque preliminares, podrían mostrar que las deleciones homocigóticas de PTEN y DMBT1 contribuyen al desarrollo de una parte de PNET supratentoriales y MB de la siguiente manera:
a. Los MB presentan más alteraciones genéticas en PTEN y DMBT1 que los PNET supratentoriales.
b. Los PNET supratentoriales tienen alteraciones en DMBT1 pero no en PTEN
c. Los MB presentan una frecuencia similar de alteraciones de PTEN y DMBT1.
No obstante, no se han demostrado diferencias significativas, debido probablemente al pequeño número de PNET supratentoriales comparado con el de MB.
2. No se detectaron deleciones homocigóticas de p14ARF o p16INK4 en niguno de los MB y PNET supratentoriales estudiados.

Hipermetilación de promotores
3. El estudio de hipermetilación de promotores podría ser de interés para subdividir los PNET centrales en cuanto a su estado de metilación:
a. La hipermetilación de PTEN parece asociarse a los MB.
b. La hipermetilación de p16INK4 es poco frecuente en MB y PNET supratentoriales.
c. La inactivación epigenética de p14ARF podría constituir un evento genético de interés en la tumorigénesis de los PNET supratentoriales, ya que se detectó en alta frecuencia en PNET supratentoriales, siendo las diferencias significativas con respecto a la metilación encontrada en MB.
d. La frecuencia de metilación del promotor de RASSF1A fue la más alta encontrada en nuestro estudio, tanto en PNET supratentoriales como en MB.

Estudio de expresión
4. Los resultados del estudio de expresión en líneas celulares se correlacionan con los resultados encontrados en tumores.
a. Ninguna de las líneas celulares de PNET analizadas expresaban RASSF1A. Estos resultados son concordandes con los del estudio de hipermetilación.
b. Se confirma la alta frecuencia de pérdida de expresión de DMBT1 en líneas celulares de PNET, sugiriéndose un importante papel de este gen en el desarrollo de estos tumores.

CGH
5. Hemos detectado diferencias en el perfil genético de ganancias y pérdidas de DNA entre MB y PNET supratentoriales.
a. El isocromosoma 17q se detecta frecuentemente en MB, mientras que se observa raramente en PNET supratentoriales.
b. Las ganancias de 1q son más frecuentes en PNET supratentoriales que en MB.
c. En MB se demostraron otras alteraciones como ganancias del cromosoma 7 y regiones del 12 así como pérdidas a nivel de los cromosomas 10, 16q y 18q. Por el contrario, los PNET supratentoriales presentaron ganancias en los cromosomas 5, 9p y 18q, así como pédidas en 9p, 16p, 19p y en el cromosoma 22.
d. Detectamos una nueva región de amplificación en dos casos de MB a nivel de 4q12, que requiere un estudio posterior más profundo.
6. Las ganancias de 1q y 9p, y las pérdidas de 8q y 17p se asocian significativamente a los PNET centrales (MB y PNET supratentoriales) y no a los PNET periféricos (tumores neuroblásticos estudiados).

El presente trabajo, en conjunto, confirma la hipótesis de que los tumores embrionarios del sistema nervioso constituyen diferentes entidades genéticas con diferentes alteraciones moleculares, independientemente de la apariencia histológica similar que presentan.

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